pfu DNA Polymerase
高保真平末端DNA聚合酶
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目錄號
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包裝
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貯存
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RTH3102-02
RTH3102-03
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100U
5×100U
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-20℃
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● 貯存
-20℃保存一年。
● 產(chǎn)品簡介
pfu DNA Polymerase是嗜熱古細(xì)菌來源的DNA聚合酶，該酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外，還具有很強(qiáng)的3’-5’外切酶活性，增強(qiáng)了PCR擴(kuò)增的保真度。與Taq酶相比，pfu聚合酶熱穩(wěn)定性更好，更能忍耐較高的變性溫度。Pfu的保真性是Taq
DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度為0.5kb/分鐘。PCR產(chǎn)物3’端不帶堿基A，為平滑末端，要通過平滑末端克隆法進(jìn)行克隆。
● 產(chǎn)品組成（RTH3102-02）
pfu DNA
Polymerase（2.5U/μl） 40μl
10×pfu
PCR buffer（含Mg2＋） 0.5 ml
● 活性定義
1單位(U) pfu DNA Polymerase活力定義為在74℃、30分鐘內(nèi)，以活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。
● 酶貯存緩沖液
50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol
● 適用范圍
高保真的DNA片段的擴(kuò)增、DNA片段的平滑化。
● 使用說明：
1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應(yīng)體系：
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成分
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20μl反應(yīng)體系
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50μl反應(yīng)體系
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終濃度
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Template
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0.04-0.2 μg
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0.1-0.5 μg
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as you wish
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Primer 1（10 μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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Primer 2（10μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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10×pfu PCR buffer(含Mg2+)
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2 μl
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5 μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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0.4 μl
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1 μl
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200 μM each
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pfu (2.5 U/μl)
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0.4 μl
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1 μl
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0.05U/μl
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ddH2O
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up to 20 μl
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up to 50 μl
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-
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注1：如果需要改變Mg2+濃度，根據(jù)下表調(diào)節(jié)
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PCR反應(yīng)體系中Mg2+終濃度
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2 mM
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2.5 mM
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3 mM
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4 mM
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20μl反應(yīng)體系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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0.4 μl
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0.8 μl
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1.6 μl
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50μl反應(yīng)體系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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1 μl
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2 μl
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4 μl
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注2：配制反應(yīng)液時(shí)，請最后加入pfu，因?yàn)楸久赣泻軓?qiáng)的3’-5’外切酶活性，有可能降解引物。
2. 混勻后，離心快甩將反應(yīng)液收集到管底。
3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話，補(bǔ)加25μl礦物油。
4. PCR儀上執(zhí)行以下程序：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數(shù)
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初始變性
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94℃
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3-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火
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50-60℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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0.5kb/min*
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據(jù)模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況，設(shè)定最佳的反應(yīng)條件（溫度、時(shí)間等）。
● 注意事項(xiàng)
1. pfu 酶具有 3’-5’的外切酶活性，所以 pfu 酶擴(kuò)增時(shí)延伸速度遠(yuǎn)比 Taq 酶低，應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度設(shè)置相應(yīng)的延伸時(shí)間，一般情況下 pfu 酶的延伸速度為每分鐘 0.5kb；同時(shí) pfu 酶的 3’-5’的外切酶活性可能降解引物，所以應(yīng)最后把pfu 酶到反應(yīng)體系中，并立即進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。
2. pfu 酶的熱穩(wěn)定性比 Taq 酶好，對于 GC 含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對 pfu 酶的活性無影響。
● 使用舉例：
水稻基因組做模板